효소조직화학 반응의 종류

대부분의 효소 조직화학 방법의 근본적인 원리는 조직세포 내에 존재하는 어떤 효소의 특이적인 기질을 가하여 생성된 반응 산물을 가시화함으로써 효소활성 죽재 부의를 보는 데 기초하고 있다. 그러나 불행하게도 이 경우 발생하는 일차반응 산물은 흔히 눈으로 볼 수 없는 물질이어서 일차반응 후 다른 물질을 가하여 불용성의 유색 반응 산물로 전환해야 한다. 이 과정은 한 단계 이상을 거치며, 반응 결과 생기는 유색 반응물질을 최종 반응 산물이라 한다. 이때 사용하는 발색제는 방법에 따라 여러 종류가 사용된다. 우선 금속침전법을 살펴보자. 1939년 고모리에 의해 고안된 방법으로 가장 오래된 효소조직화학적 반응이며, 이 방법이 나오게 되면서부터 효소조직화학이 활기를 띠게 되었다. 효소작용에 의한 기질의 분해 산물은 금속 또는 금속염과 이온 결합하여 효소활성 국제 부위에 가시 반응 산물을 형성한다. 일반적으로 금속이나 금속염은 광학 현미경적 관찰에 적당한 짙은 착생 반응 산물을 만들 뿐만 아니라 금속 자체의 전자선을 방출하는 성질이 있기 때문에 반응 산물을 전자현미경적으로도 관찰할 수 있다. 기질이 분해된 후의 가시 산물 형성 과정은 한 단계 또는 두 단계 이상의 반응으로 진행되지만 3단계 이상의 반응은 드물다. 보통 반응 단계의 수가 많으면 반응의 감도가 낮거나 반응 산물이 정확히 효소활성 국제 부위에 존재하지 않는다. 이 방법은 가수분해효소, 탈수소효소 활성을 비롯하여 알돌 레이스, 탄산탈수효소 등의 특수한 효소활성 검출에 이용된다. 아주 염색법은 효소의 분해작용에 의해 기질로부터 생성된 산물을 디아조늄염과 반응시켜 효소 활성 국제 부위에 가시 산물을 형성시켜 관찰하는 방법이다. 일반적으로 아조화합물은 강한 착색을 나타내지 않으나 이것이 기질의 분해 산물과 결합한 후 청색, 흑색, 녹색, 갈색, 자색 등의 광학 현미경적으로 구별하기 쉬운 짙은 착색을 나타내는 아주 색소가 된다. 효소기질로 가장 빈번하게 사용되는 것은 1 또는 2 나프톨, 나프톨, 나프틸아민, 인 독실히나 인 독실아민 등이다. 디아조늄염에는 Fast라 칭하는 명칭을 사용하는 화합물이 많고, 명칭의 Fast 다음의 blue나 red라 하는 문자가 연결되어 있는데, 이것은 나프톨계 화합물과 짝짓기 된 때의 발색 되는 색을 의미한다. 디아조늄염의 안정성은 반응기 질액의 pH, 온도 등에 영향을 받으며, 일반적으로 알칼리 쪽으로 기울면 저하한다. 따라서 반응을 37도의 알칼리 쪽에서 수행할 경우에는 반응기질액을 반응의 중도에서 교환하는 것이 권장되고 있다. 알칼리에서 분해된 디아조늄염은 반응 부위 이외에 침착하여 반응의 국제가 부정확하게 된다. 그러나 다른 면에서는 효소 반응 기질에서 유리된 분해 산물과 디아조늄염의 반응은 알칼리 쪽에서 빠르게 일어난다. 이 경우 주의할 점은 디아조늄염에 의한 효소반응의 저해 효과이다. 이것은 디아조늄 화합물 자체에 의한 것과 함유된 금속이온에 의한 것이다. 이런 점을 고려하여 적당한 디아조늄염을 선택할 필요가 있다. 아주 염색법에는 반응기 질액에 디아조늄염을 함께 첨가하여 수행하는 동시 짝짓기법과 먼저 나프톨계의 적당한 기질과 반응을 시킨 후 침착된 나프톨 등을 후에 디아조늄염과 짝짓기 시킨 후 짝짓기법이 있다. 동시 짝짓기법의 원리는 절편 내에 존재하는 효소가 기질을 가수분해하여 비가시성의 일차반응 산물을 형성한 다음, 이 복합체가 즉시 디아조늄염과 결합하여 가시성의 유색 최종 반응 산물을 생성하는 데 기초하고 있다. 이 종류 방법의 좋은 예로는 인산분해효소 검출을 위한 아주 염색법을 들 수 있다. 이 경우 PRP는 무색이지만, FRP는 항상 유색이어야 한다. 또한 효소는 기질을 가수분해할 만한 양이 포함되어야 하고 기질은 반드시 물이나 완충액에 용해될 수 있어야 한다. 이 반응은 효소의 최대 활성과 적당한 기질 용해성을 보이는 pH에서 수행하여야 한다. 또한 디아조늄염은 가장 효과적인 짝짓기 비율을 나타낼 수 있는 최적 pH가 있기 때문에 이 방법을 선택할 때 수행할 방법의 pH를 고려해야 한다. 동시 짝짓기법에서의 PRP는 어느 정도 불용성이어야 한다. 만일 PRP가 너무 쉽게 용해되면 디아조늄염과 짝짓기가 거의 일어나지 않는다. 또한 반응액 내의 기질과 디아조늄염의 양도 중요하다. ㅇ 두 성분이 너무 많으면 한편으로는 기질의 가수분해율이 억제되며, 다른 하 편으로는 FRP의 형성이 억제된다. 후 짝짓기법에서는 효소가 기질을 가수분해하여 상당히 불용성인 PRP를 생성한다. 그 후 짝짓기 과정은 분리된 용액에서 수행한다. 이 종류의 방법은 첫 가수분해 부위에 남아있는 PRP에 의존한다. 또한 짝짓기 과정에서 PRP의 확산이 발생하지 않아야 한다. 후 짝짓기법은 많은 이론적인 장점을 가지고 있다. 이 장점 중 하나는 첫 기질 효소반응에 대한 최적 pH를 첫 반응에서 달성할 수 있으며, 두 번째 짝짓기 단계에서 최적 pH를 달리할 수 있다. 이 방법에서는 디아조늄염에 오래 반응시키면 효소가 불활성화되거나 가수분해를 간섭하기 때문에 첫 반응 시 디아조늄염에 의해 발생할 수 있는 나쁜 영향을 피해야 한다. 즉 산이나 알칼리 용액 내의 디아조늄염이 조직에 오래 접촉하면 비특이적인 염색이 발생한다. 후 짝짓기법은 2단계 반응 과정을 통과하기 때문에 두 반응 사이에서 PRP의 용해로 인해 국제 부위의 과다한 확산을 초래하기 쉽다는 결점이 있다. 이제 효소 반응의 종류에 대해 살펴보았으니 근 생체검사의 적용에 대해 알아보도록 하자.